Diabetologia：激活但动态受损的记忆Tregs在1型糖尿病患者进展缓慢的过程中逐渐扩展

从第一次显现出胰脏自身突变到显现出1改进型心血管疾病临床病因的实质性所部在老年人时期就有很好的刻画，多个胰脏自身突变无症状的老年人当中亦有70%在肝脏匹配后10天内患上心血管疾病，而随访15年的老年人这一%增大到84%。相比之下，占总临床1改进型心血管疾病一半以上的改进型1改进型心血管疾病的确诊机制还没给予充分的分析。

越来越多的人开始常用分期种系统来定义1改进型心血管疾病的实质性：性状在显现出多种胰脏自身突变时进入第1期当中，显现出浓度异常时进入第2期当中，显现出病因时进入第3期当中。一些多发胰脏自身突变无症状的性状，在1期和2期，实质性较慢速，并持续发展为确诊的1改进型心血管疾病。我们前刻画了一第三组在首次检验到多种胰脏自身突变抽样后至较少10年无心血管疾病的极慢速实质性者，这第三组病人人数较少，但特质比较确切。随后，我们辨认出胰脏自身细胞质特异性CD8+T细胞核反应当在实质性极快的病人当中必需不存在，但在现阶段确诊和长时间存在的心血管疾病病人当中很容易检验到。这有可能指出，与实质性病人相比，这些病人自身突变的调节增强。

早期分析指出，尽管调节性T细胞核(Treg)为数较长整整，但心血管疾病病人存在一些机能缺点，其当中包含对IL-2的反应当灵活性降低。此外，心血管疾病病人当中的振荡CD4+T细胞核有可能对调节更为具抵抗性，显出为振荡T细胞核的诱发减弱，自然导致的Treg和活体导致的诱发Treg，以及细胞质经历的CD4+T细胞核当中IL-2反应当减弱。本分析的目的是刻画了CD4+调节性T细胞核(Treg)在一小群极极快实质性者当中的特质，他们的平均年龄第三组为43岁(31-72岁)，随访整整为18-32年。

方法：BOX分析是一项以人群为基础的纵向分析，在21岁表列出确诊的病人亲属当中检查1改进型心血管疾病的危险因素。我们前刻画了长时间极快实质性者的特质，他们保证多重胰脏自身突变无症状超过10年，但没显现出心血管疾病的临床病因，慢速性或非进行时性免疫性。随后，10名独自保证无心血管疾病并愿意提供大量血液循环抽样的极快实质性者扩及T和B细胞核机能分析。在目前的分析当中，8名慢速实质性者(SP第三组)，当中位年龄第三组43岁(31-72岁)，18 - 32岁间的胰脏自身突变无症状。所有的组织者都处于1改进型心血管疾病实质性的1期，尽管一些人随后保住了胰脏自身突变对某些细胞质的抽血，然而，一名病人仍未处于2期至较少6年，但没显现出临床病因，一名病人被诊断为心血管疾病，该受试者72岁，在捕获物理抽样时，其HbA1c下降时到53 mmol/mol(7%)，在数据分析当中对该小分兄进行时了实质上指标。分开外周血单个核细胞核(PBMCs)，选用多数值流式细胞核忍术和T细胞核诱发试验性指标小分兄当中Treg的高频所部、表改进型和机能。常用FlowSOM和CITRUS(聚类核对、表征和回归)进行时无指派聚类分析，指标Treg表改进型。

结果：与健康小分兄相比，来自慢速实质性体的清醒CD4+T细胞核的指派聚类推测，酪氨酸的清醒CD4+ Treg高频所部增大，与糖皮质激素诱发的TNFR之外细胞(GITR)暗示增大有关。一名HbA1c下降时的病人与实质性极快者和反之亦然的对照第三组相比，Treg谱有所相同。机能分析指出，与健康小分兄相比，来自极快实质性体的Treg激活的CD4+振荡T细胞核诱发明显损坏。显出为对振荡CD4+T细胞核CD25和CD134暗示的诱发增大。

左图1 深入的表改进型分析推测，CD4+Treg亚改进型在慢速实质性数据流当中增大。由FlowSOM作用于的Treg室，聚集在来自所有小分兄的活CD4+CD45RA -细胞核上。根据标示出物暗示核对出10个元簇:清醒T细胞核_1;清醒T cell_2;清醒T cell_3;清醒T cell_4;CD49b清醒T细胞核;HLA-DR + GITR +清醒T细胞核;线程Treg_1;线程Treg_2;线程Treg_3;和线程Treg_4。(a)常用9个相同Treg标示出作用于的10个元簇的MST。每个节点代表者一个集群(100个集群)，更为大的元集群(10个元集群)在节点第三组一处上色。每个节点当中的年糕左图暗示单个标示出的暗示层次。(b)每个元聚类的热左图，以推测必需标示出暗示。(c, d)为HD第三组(c)和SP第三组(d)作用于左图，以及FlowSOM标识的每个元簇的较厚。(e-l)比起总质量为每个metacluster装有支线左图(总质量> 0.05%)确定为HD和SP第三组:线程Treg_2 (e),线程Treg_3 (f),线程Treg_4 (g), HLA-DR + GITR +清醒T细胞核(h)、清醒T cell_1(i),清醒T cell_2 (j),清醒T cell_3 (k) n d CD49b清醒T细胞核(l)。绿色红色代表者**SP 606。**p< 0.01, Wilcoxon配对符号秩检验。此键适用于左图形部分(a)， (c)， (d)和d (e-l)

左图2 常用CITRUS的预测模改进型证明，Treg高频所部的增大是实质性极快的标记。层次门控(a - f)和柑橘分析(g-k)相比较SP组织者和反之亦然的HD组织者在CD4+CD45RA−T细胞核上的差异。(a)杂交CD25+ cd127 lotreg和CD25loCD127+T c e l小团体的代表者性左图。CD25+ cd127lotreg被CD39和FOXP3钼，然后通过HLA-DR和GITR暗示进行时分开，实时FlowSOM小团体。(b) HD(黑点)和SP(蓝点)第三组以及小分兄SP 606(绿色)当中CD25+ cd127的高频所部综合左图。(c-f) CD25+CD127loCD39+FOXP3+和CD25loCD127+门控兄集的装有支线左图;(c) HLA-DRloGITR−(线程Treg_2)， (d) HLA-DRintGITRlo(线程Treg_3)， (e) HLA- d RhiGITR+(线程Treg_4)， (f) HLA- d RhiGITR+(HLA-DR+GITR+线程T cell)。(g - i)玉米簇螺旋由(g) CD127， (h) CD25和(i) FOXP3暗示风速着色，箭头厚实的簇被标识为SP和HD数据流间的相同。(j)装有支线左图推测了在SP(蓝点)和HD(灰点)第三组当中，CITRUS清醒Treg_3和Treg_4的比起总质量(%)。(k)直方左图推测每个簇的表改进型(暗红色)和Treg标示出比起暗示与剧中暗示(金色);上列，线程Treg_3;下面即刻，线程Treg_4。剧中与所有其他簇当中标示出的暗示有关。*p< 0.05， **p< 0.01, Wilcoxon配对符号秩检验

左图3 与健康献血者相比，实质性极快者清醒treg的GITR增大。每个清醒CD4+T细胞核元簇(清醒T细胞核_1;清醒T cell_2;清醒T cell_3;CD49b +清醒T细胞核;HLA-DR + GITR +清醒T细胞核;线程Treg_2;线程Treg_3;来自FlowSOM的memory Treg_4)检验每个暗示标示出的变动。(a,b)来自HD (a)和S (b)数据流的暗示热左图(sp606不包含在内)。(c,d)清醒Treg_4元簇当中所有HD(灰色)、所有SP(金色)和SP 606(绿色)的FlowSOM GITR暗示串联，推测直方左图(c)和综合左图(d)。Wilcoxon配对符号秩和检验，p< 0.07(绿色)所有小分兄包含，p< 0.05(金色)小分兄SP 606和反之亦然的HD不包含在测试当中。(e,f) HLA-DRhiGITR+Tregs当中GITR暗示，从层次门控，从所有HD(灰色)、所有SP(金色)和SP 606(绿色)串联，推测直方左图(e)和综合左图(f) *p< 0.05, Wilcoxon配对符号秩检验

左图4 来自极快实质性的CD4+ treg细胞核遏制振荡CD4+T细胞核的灵活性降低。SP第三组用金色的支线和红色暗示，HD第三组用紫色的支线和红色暗示，绿色的支线/红色暗示小分兄sp606。常用CD4+CD25+ Treg分选试剂盒对CD4+T细胞核进行时分选。CD4+CD25−(应当答者)被标示出为CFSE, Treg按捕捉到的%反应当物。用抗CD3 /28微珠激活细胞核，培植3天后进行时流式细胞核忍术检验。(a-d)与CD4+应当答者比起应当的treg培植(继发性)(e-h) HD、SP或SP 606 Treg与HD应当答者培植。(a,b,f) CFSE增殖(a,e)和CFSE诱发比率(b,f)。(c, d,h) CD25 (c,g)和CD134 (d,h)的诱发比率。常用无症状对照(酪氨酸的响应当细胞核不含treg)算出诱发比率。*p< 0.05， **p< 0.01， ***p< 0.001，重复测量双向方差分析。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重相比较测试

左图5 振荡CD4+T细胞核对极快实质性的T细胞核激活的诱发更为敏感性。SP第三组用金色的支线和红色暗示，HD第三组用紫色的支线和红色暗示，绿色的支线/红色暗示小分兄sp606。常用CD4+CD25+Treg分选试剂盒对CD4+T细胞核进行时分选。CD4+CD25−(应当答者)被cfsel标示出，treg按捕捉到的%反应当物。用抗CD3 /28微珠激活细胞核，培植3天后进行时流式细胞核忍术(CD25反染)和细胞核因兄分析。HD Treg与HD、SP或sp606应当答者共同完成培植。(a,b) CFSE增殖(a)和CFSE诱发百分所部(b)。(c,d) CD25诱发百分所部(c)和CD134诱发百分所部(d)。(e,f) IFN-γ(e)和IL-17A (f)在共培植当中的暗示。***p< 0.001， **p< 0.01，重复测量双向方差分析。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重相比较测试

结论：我们得出的结论是，来自极快实质性兄的激活清醒CD4+Treg在GITR暗示当中给予了扩展到和丰富，强调了进一步分析Treg在1改进型心血管疾病效用性状当中的表征的必要性。

注解典故：

Boldison J, Long AE, Aitken RJ,et al.Activated but functionally impaired memory Tregs are expanded in slow progressors to type 1 diabetes.Diabetologia 2021 Oct 28